|
|
Strukturní analýza interakčního rozhraní mezi protilátkou a proteinovým epitopem
Moravec, Jan ; Krejčíř, Radovan (oponent) ; Müller,, Petr (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá studiem myší monoklonální protilátky EEV1-2.1, která byla vytvořena v laboratořích RECAMO imunizací myši proteinem Hsp90 a následnou fúzí splenocytů s myší myelomovou linii. Teoretická část této práce se zaměřuje především na studium protilátek, zejména jejich struktury, genetiky a popis monoklonálních protilátek. V této části práce lze dále najít průřez moderními biotechnologickými trendy, které jsou v současné době používány k produkci protilátek. Dále jsou popsány CHO buňky a tetracyklinové inducibilní systémy. Cílem diplomové práce bylo charakterizovat zmíněnou protilátku. Pomocí bioinformatických metod a predikčních softwarů predikovat a popsat její strukturu, především potom analyzovat hypervariabilní CDR oblasti. Dalším cílem bylo pomocí metody Gateway klonovat lehký a těžký řetězec protilátky. Finálním krokem bylo vytvoření tetracyklinového inducibilního systému pro efektivní produkci samotné protilátky. Experimentální část práce se úvodem zabývá izolací RNA sekvence protilátky pomocí komerčních kitů. Dále je popsána metoda amplifikace dané sekvence pomocí PCR s reverzní transkripcí. Následuje popis metody Gateway klonování, která umožňuje pohodlné vložení vybraného genu do cílového vektoru. Objasněny jsou též základní bioinformatické metody použité ke studiu struktury protilátek a také predikce komplexnější 3D struktury protilátky včetně možných interakcí s proteinem HSP90. V této části lze najít popis metod transfekce ExpiCHO buněk a inducibilní produkce protilátky využívající tetracyklinový inducibilní systém. Diplomová práce vedla k úspěšnému naklonování lehkého a těžkého řetězce protilátky a následnému vložení expresního vektoru do produkčních ExpiCHO buněk. Expresní systém na bázi indukce přídavkem doxycyklinu byl poté úspěšně testován několika metodami a výsledky ukazují, že je inducibilní systém nejen funkční, ale může dokonce vést ke zvýšené produkci monoklonální protilátky oproti konvenčním metodám.
|
|
|
Vliv mutace S159A na oligomerní stav NKR-P1A receptoru lidských NK buněk
Hausleitner, Filip ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Kožíšek, Milan (oponent)
Přirozeně zabíječské buňky (NK buňky) jsou lymfocyty schopné ničit nádorové a viry infikované buňky bez předešlé antigenní senzitizace. Využívají k tomu svoje aktivační a inhibiční povrchové receptory, které interagují s povrchovými molekulami cílových buněk. Imunitní odpověď NK buněk závisí na celkovém součtu signálů z obou typů receptorů. Receptor NKR-P1A lidských NK buněk patří do strukturní rodiny receptorů podobných lektinům C-typu. Tento receptor interaguje s jeho ligandem LLT1 ze stejné proteinové rodiny, přičemž tato interakce je charakterizována nízkou afinitou a vysokou specifitou. Vytvoření komplexu NKR-P1A:LLT1 mezi NK buňkou a cílovou buňkou inhibuje cytotoxicitu NK buňky, a tak je součástí regulace imunitní odpovědi. V této práci byl studován vliv mutace S159A na oligomerní stav rozpustné ektodomény lidského NKR-P1A v roztoku. Pro tento účel byla úspěšně rekombinantně připravená mutantní forma rozpustné ektodomény lidského NKR-P1A G90-S225 S159A ve stabilně transfekovaných lidských embryonálních ledvinných buňkách 293 (HEK293S GnTI" ). Připravený konstrukt byl purifikován pomocí afinitní a gelové permeační chromatografie a následně analyzován pomocí SDS-PAGE a sedimentační analýzy. Výsledky potvrzují, že absence N-vázané glykosylace v pozici 157 podporuje dimerizaci ektodomény v...
|
|
|
Strukturní studium potkaního NK buněčného receptoru NKR-P1B a jeho ligandu Clrb
Skořepa, Ondřej ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
NK buňky vykazují unikátní schopnost rozeznávat a způsobit smrt nádorových, či virem infikovaných buněk bez předchozí senzitizace antigenem. Jejich funkce je regulována vyváženými signály indukovanými aktivačními a inhibičními povrchovými receptory při interakci s ligandy cílové buňky. To může být ilustrováno na potkaním receptoru NKR-P1B a jeho ligandu Clrb, které hrají mimo jiné zásadní roli v odpovědi NK buněk na infekci potkaním cytomegalovirem (RCMV). Během infekce RCMV cílová buňka snižuje expresi ligandu Clrb a tím snižuje inhibiční signál přenášený skrze NKR-P1B do NK buňky, to v ideálním případě vede k aktivaci NK buňky a lyzi infikované buňky. Nicméně, RCMV obsahuje gen pro falešný povrchový receptor - RCTL, který napodobuje Clrb, a tak napomáhá úniku před imunitní odpovědí NK buněk. Zatímco tato úniková strategie byla zaznamenána v kmeni potkanů WAG, ukázalo se, že NKR-P1B homolog z potkaního kmene SD váže pouze Clrb a nerozeznává RCTL. Díky tomu je SD kmen méně citlivý k infekci RCMV. Tato práce si klade za cíl poodhalit molekulární základ NKR-P1B:Clrb receptor- ligandového rozeznávání, přičemž vychází z našich dřívějších úspěšných výsledků získaných pro lidský NKR-P1:LLT1 receptor-ligandový pár. Ukázalo se, že pro následnou krystalizaci NK buněčných receptorů a jejich ligandů je...
|
|
|
Transgenic technologies based on transposons
Dobiášovská, Ivana ; Kozmik, Zbyněk (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Genové inženýrství je jednou z vedoucích technologií biologického výzkumu. Transgeneze, jedna z nejvýznamnější technik genového inženýrství, umožňuje studium genetických aspektů organismálních systémů a napomáhá tak pochopení funkce a struktury genomů. Transposony jsou přirozeně se vyskytující mobilní genetické elementy, které mohou být uměle využity k začlenění transgenu do genomu hostitelských buněk. Katalýza tohoto zásadního kroku v průběhu transgeneze činí transposony užitečným genetickým nástrojem. Práce usiluje o prezentaci eukaryotických DNA transposonů využívajích cut-and-paste mechanismus integrace, společně s významnými mechanismy ovlivňujícími jejich funkci jako možnosti vhodných systémů pro genový přenos.
|
|
|
Příprava prasečích indukovaných pluripotentních kmenových buněk - model Huntingtonovy choroby.
Svobodová, Eliška ; Motlík, Jan (vedoucí práce) ; Fulka, Josef (oponent)
Dosud se nepodařilo vytvořit stabilní linie prasečích ESCs. Linie prasečích ES like buněk nejsou schopné dlouhodobé sebeobnovy nebo mají omezenou schopnost diferenciace. Alternativou k pESCs jsou piPSCs, které lze vytvořit přeprogramováním somatických buněk několika transkripčními faktory nesenými virovými vektory. Linie piPSCs se podařilo vytvořit několika skupinám. Většina linií piPSCs je ale závislá na transgenní expresi z důvodu nedokončeného procesu přeprogramování a nedostatečné aktivace vlastních genů pluripotence. Zvýšená exprese vnesených transgenů má negativní vliv na schopnost diferenciace piPSCs. Proto byly pro vytvoření piPSCs v této práci použity nevirové Piggybac transpozony, které lze z genomu zpětně vystřihnout. Zároveň byly pro přeprogramování použity malé molekuly (nízkomolekulární inhibitory), které jsou schopné zvýšit účinnost přeprogramování a aktivaci endogenních genů pluripotence. Tento systém pro vytvoření piPSCs má potenciál k vytvoření piPSCs v naivním stavu pluripotence. Po vystřižení transgenů je možné získat piPSCs bez inserčních mutací a s neomezenou schopností diferenciace. Prase (Sus Scrofa) je zároveň důležitým zvířecím modelem pro preklinické stadium výzkumu nemocí. Pro vytvoření piPSCs byly použity primární buňky z prasat s mutovaným huntingtinem. Integrace sekvence...
|
host ::
RSS.